Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease nội tạng và đầu tôm sú

v

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Nguyễn Văn Nam, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2007.
“TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI
TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon)”.
Hội đồng giáo viên hƣớng dẫn:
 PGS-TS. Nguyễn Tiến Thắng.
 Ths. Nguyễn Lệ Hà.
Để hiểu biết về tính chất và sự biến đổi của hệ protease nhằm có những biện
pháp bảo quản hữu hiệu trong chế biến nguyên liệu tôm sau khi thu hoạch và tận
dụng triệt để nguồn phế phụ phẩm của tôm để thu chế phẩm protease.
Đề tài tiến hành khảo sát khả năng tách chiết protease từ mẫu đầu và nội tạng
tôm của dung môi: nƣớc cất, nƣớc muối sinh lý, đệm phosphate và Tris-HCl với các
tỷ lệ khác nhau. Chọn ra dung môi với tỷ lệ chiết thích hợp thu DC; Khảo sát khả
năng tủa của các tác nhân: cồn ethylic, acetone và muối sulfate amon với các nồng
độ (tỷ lệ) khác nhau. Chọn tác nhân tủa với nồng độ (tỷ lệ) thích hợp tủa DC thu
CPT; Khảo sát các tính chất tối ƣu cho hoạt động protease CPT của mẫu nội tạng từ
tác nhân tủa tốt nhất; Tinh sạch protease CPT của các tác nhân tủa với nồng độ
thích hợp từ mẫu nội tạng và mẫu đầu tôm bằng sắc ký lọc gel áp suất thấp, Bio-Gel
P 100. Xác định trọng lƣợng phân tử protease sau tinh sạch bằng kỹ thuật điện di
SDS-PAGE.
Kết quả thí nghiệm: dung môi tách chiết Tris-HCl với tỷ lệ mẫu/dd Tris-
HCl =1/7 (w/v); Tác nhân tủa cồn với tỷ lệ DC/dd cồn = 1/6 (v/v); Protease CPT tủa
cồn của mẫu nội tạng hoạt động tối ƣu ở nhiệt độ 47
o
C, pH 7,0, nồng độ muối ăn
3%. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy enzyme sau tinh sạch có trọng lƣợng phân
tử nằm trong khoảng từ 37.775 Da đến 69.257 Da.


vi
MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN IV
TÓM TẮT KHÓA LUẬN V
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT IX
DANH SÁCH CÁC BẢNG X
DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ XI
Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.2. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 2
Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME 3
2.1.1. Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme 3
2.1.2. Định nghĩa về enzyme 4
2.1.3. Cấu tạo phân tử 4
2.1.4. Danh pháp quốc tế và phân loại 6
2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme 6
2.2. KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA TÔM 8
2.2.1. Giới thiệu về tôm 8
2.2.2. Khái quát protease 10
2.2.2.1. Định nghĩa protease 10
2.2.2.2. Protease của tôm 11
2.2.2.3. Tình hình nghiên cứu protease trong nƣớc và ngoài nƣớc 12
a). Nghiên cứu trong nƣớc 12
b). Nghiên cứu ngoài nƣớc 13
2.2.3. Ứng dụng của protease 14
2.3. PHƢƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN
CỨU 15
2.3.1. Phương pháp trích ly enzyme. 15
2.3.2. Phương pháp làm sạch enzyme 16
2.3.3. Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel 18
2.3.3.1. Bản chất của phƣơng pháp 18
2.3.3.2. Chọn lựa và chuẩn bị gel 20
a). Chọn lựa gel 20
b). Chuẩn bị gel và bảo quản 20
2.3.3.3. Dựng cột và chuẩn bị mẫu 20
a). Dựng cột lọc gel 20
b). Chuẩn bị mẫu 21
2.3.3.4. Một số ứng dụng của phƣơng pháp lọc gel 21

vii
2.3.3.5. Ƣu và nhƣợc điểm của sắc ký lọc gel 22
a). Ƣu điểm 22
b). Nhƣợc điểm 22
2.4. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE 22
2.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME 24
2.5.1. Phương pháp Biuret 24
2.5.2. Phương pháp Lowry 25
2.5.3. Phương pháp Bradford 25
2.5.4. Phương pháp BCA [Bicinchoninic Acid] (1985) 26
2.5.5. Phương pháp đo phổ 26
Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 27
3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 27
3.2.1. Vật liệu 27
3.2.2. Hóa chất 28
3.2.3. Thiết bị 28
3.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG 29
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú 29
3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease 29
3.4.3. Bố trí thí nghiệm 30
3.4.3.1. Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu
tôm sú thích hợp 31
3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC 32
3.4.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của CPT 33
a). Nhiệt độ 33
b). pH 33
c). Nồng độ muối ăn 34
3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel 35
3.4.5. Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 35
3.4.6. Phương pháp xử lý số liệu 35
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
4.1. XÁC ĐỊNH DUNG MÔI VÀ TỶ LỆ CHIẾT TÁCH ENZYME 36
4.1.1. Khả năng tách chiết protease của nước cất ở các tỷ lệ khác nhau 36
4.1.2. Khả năng tách chiết protease của nước muối sinh lý ở các tỷ lệ khác
nhau 38
4.1.3. Khả năng tách chiết protease của đệm phosphate pH 7,0 ở các tỷ lệ khác
nhau 39
4.1.4. Khả năng tách chiết protease của đệm Tris-HCl pH 7,5 ở các tỷ lệ khác
nhau 41
4.1.5. Lựa chọn dung môi tách chiết protein-enzyme thích hợp 42
4.2. XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN TỦA THU HỒI CHẾ PHẨM TỪ DC 44

viii
4.2.1. Khả năng tủa protease của cồn ở các tỷ lệ khác nhau 44
4.2.2. Khả năng tủa protease của acetone ở các nồng độ khác nhau 46
4.2.3. Khả năng tủa protease của (NH
4
)
2
SO
4
ở các nồng độ muối bão hòa khác
nhau 47
4.2.4. So sánh khả năng tủa thu CPT của các tác nhân 49
4.3. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH
PROTEASE CỦA CPT 51
4.3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme proease của CPT từ mẫu nội
tạng tôm sú 51
4.3.2. Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú
52
4.3.3. Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội
tạng tôm sú 53
4.4. TINH SẠCH PROTEASE CPT BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL 55
4.5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ- ĐIỆN DI SDS – PAGE 59
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64
5.1. KẾT LUẬN 64
5.2. ĐỀ NGHỊ 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
PHỤ LỤC 1
Phụ lục chƣơng 3 69
1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford 1
2. Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Amano 3
3. Phương pháp sắc ký lọc gel 7
4. Điện di SDS-PAGE 9
a). Chuẩn bị hộp điện di 9
b). Chuẩn bị mẫu protein 10
c). Đƣa mẫu vào các giếng 10
Phụ lục chƣơng 4 80







ix

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

NT: nội tạng.
DC: dịch chiết.
CPT: chế phẩm thô.
TN: thí nghiệm.
ĐC: đối chứng.
dd: dung dịch.
HT: hoạt tính.
HTR: hoạt tính riêng.
HL: hàm lƣợng.
MW: molecular weight
OD: optical density
SDS: sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis
TEMED : N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine
UV: ultra viole













x

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng Trang
Bảng 2.1. Nội dung các nhóm phƣơng pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme
24
Bảng 4.5. Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease từ DC của các dung môi của
mẫu nội tạng và đầu 42
Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng
protease của CPT 49
Bảng 4.14. Hoạt tính riênng, độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch của enyzme
protease sau sắc ký lọc gel 58
Bảng 4.16. Trọng lƣợng phân tử protein mẫu nội tạng chạy điện di SDS-PAGE 62
Bảng 4.17. Trọng lƣợng phân tử protein mẫu đầu chạy điện di SDS-PAGE 62



























xi


DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình Trang
Hình 2.1. Tôm sú 9
Hình 2.2. Công thức cấu tạo protease 10
Hình 2.3. Nguyên tắc hoạt động của sắc ký 17
Hình 2.4. Tách các phân tử bằng lọc gel 18
Hình 2.5. Sắc ký lọc gel loại muối 21
Hình 2.6. Công thức cấu tạo chất màu Coomassie. 26
Hình 3.1. Mẫu nội tạng và đầu tôm sú 27
Hình 4.1. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa
cồn từ DC mẫu nội tạng 55
Hình 4.2. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa
cồn từ DC mẫu đầu tôm 55
Hình 4.3. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P100 của CPT tủa
acetone từ DC mẫu nội tạng 56
Hình 4.4. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P100 của CPT tủa
acetone từ DC mẫu đầu tôm 56
Hình 4.5. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa muối
(NH
4
)
2
SO
4
từ DC mẫu nội tạng 57
Hình 4.6. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa
muối (NH
4
)
2
SO
4
từ DC mẫu đầu 57
Hình 4.7. Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu nội tạng 60
Hình 4.8. Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu đầu 60

Đồ Thị

Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/nƣớc cất) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng
protein của DC nội tạng 36
Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu /nƣớc cất) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng
protein của DC đầu tôm sú 37
Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/nƣớc muối sinh lý) đến hoạt tính protease
và hàm lƣợng protein của DC nội tạng 38
Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/nƣớc muối sinh lý) đến hoạt tính protease
và hàm lƣợng protein của DC đầu 38
Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/đệm phosphate) đến hoạt tính protease
và hàm lƣợng protein của DC nội tạng 39
Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/đệm phosphate) đến hoạt tính protease
và hàm lƣợng protein của DC đầu 40

xii
Đồ thị 4.7. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/đệm Tris-HCl) đến hoạt tính protease và
hàm lƣợng protein của DC nội tạng 41
Đồ thị 4.8. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/đệm Tris-HCl) đến hoạt tính protease và
hàm lƣợng protein của DC đầu 41
Đồ thị 4.9. Ảnh hƣởng loại dung môi chiết đến hoạt tính protease và hàm
lƣợng protein của DC nội tạng 43
Đồ thị 4.10. Ảnh hƣởng loại dung môi chiết đến hoạt tính protease và hàm
lƣợng protein của DC đầu 43
Đồ thị 4.11. Ảnh hƣởng của tỷ lệ (DC NT/cồn) đến hoạt tính protease và
hàm lƣợng protein của CPT 45
Đồ thị 4.12. Ảnh hƣởng của tỷ lệ (DC đầu/cồn) đến hoạt tính protease và
hàm lƣợng protein của CPT 45
Đồ thị 4.13. Ảnh hƣởng nồng độ acetone đến hoạt tính protease và hàm lƣợng
protein của CPT từ mẫu nội tạng 46
Đồ thị 4.14. Ảnh hƣởng nồng độ acetone đến hoạt tính protease và hàm lƣợng
protein của CPT từ mẫu đầu 47
Đồ thị 4.15. Ảnh hƣởng nồng độ phần trăm muối (NH
4
)
2
SO
4
bão hòa đến
hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu nội tạng 48
Đồ thị 4.16. Ảnh hƣởng nồng độ phần trăm muối (NH
4
)
2
SO
4
bão hòa đến
hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu đầu 48
Đồ thị 4.17. Ảnh hƣởng của các tác nhân đến hoạt tính protease và hàm lƣợng
protein của CPT từ DC mẫu nội tạng 49
Đồ thị 4.17. Ảnh hƣởng của các tác nhân đến hoạt tính protease và hàm lƣợng
protein của CPT từ DC mẫu đầu 50
Đồ thị 4.19. Yếu tố nhiệt độ ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của CPT 51
Đồ thị 4.20. Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính protease của CPT 53
Đồ thị 4.21. Ảnh hƣởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT 54
Đồ thị 4.22. Ảnh hƣởng của quá trình tinh sạch sắc ký lọc gel đến HTR
của enzyme 58
Đồ thị 4.23. Sự tƣơng quan giữa giá trị Rf và Lg (trọng lƣợng phân tử) 61







1


Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme đƣợc phát triển rất mạnh từ đầu
thế kỷ 20 đến nay. Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại lợi nhuận lớn cho nhiều
nƣớc, sản lƣợng và kim ngạch mua bán các chế phẩm enzyme trên thị trƣờng thế
gới tăng 20-30% mỗi năm. Việt Nam là nƣớc có nhiều nghiên cứu và ứng dụng
enzyme. Trong đó protease là enzyme thủy phân có giá trị thƣơng mại rất lớn. Nó
đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp, nông nghiệp, mỹ
phẩm đặc biệt trong y học hiện đại. Chính vì thế đã có nhiều nghiên cứu tách chiết
thu nhận protease từ nhiều nguồn gốc khác nhau: động vật, thực vật, vi sinh vât.
Gần đây, do những nhu cầu về vệ sinh, an toàn thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt,
chi phí cho kiểm tra chất lƣợng và do đó, chế phẩm protease từ vi sinh vật ngày
càng cao. Trong khi đó, chế phẩm protease thu nhận từ thực vật và mô động vật
luôn đƣợc coi là tuyệt đối an toàn nên ngày càng thu hút đƣợc sự quan tâm của các
phòng thí nghiệm cũng nhƣ các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thƣơng
mại.
Tôm là loại động vật thuỷ sinh đang đứng đầu trong ngành nuôi trồng thuỷ
sản. Với mức đóng góp 70 - 80% giá trị tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản nên
hiện nay tôm là mặt hàng chế biến xuất khẩu chủ lực của ngành, chủ yếu là tôm
đông lạnh. Tôm là thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao (chứa 21,04% protein –
nghiên cứu của Nguyễn Việt Dũng về tôm sú) nên nó là mặt hàng rất đƣợc ƣa
chuộng trên thị trƣờng quốc tế. Tôm dùng cho chế biến đƣợc cung cấp từ hai nguồn:
đánh bắt và nuôi trồng, trong đó nguồn tôm nuôi đang chiếm ƣu thế và nuôi tôm ở
Việt Nam trong những năm gần đây đã trở thành ngành kinh tế quan trọng. Các sản
phẩm chế biến tôm chủ yếu là tôm bỏ vỏ, bỏ đầu, tôm bỏ đầu bóc vỏ còn đuôi, tôm
2

thịt xẻ lƣng … Trong quá trình gia công chế biến tôm thƣờng loại ra các phế phụ
phẩm nhƣ nội tạng, đầu và vỏ tôm. Phế phụ phẩm này của tôm là nguồn thu nhận
protease cao, mang lại lợi nhuận lớn cho công nghiệp sản xuất enzyme.
Để hiểu về tính chất và sự biến đổi của hệ protease nhằm có biện pháp hữu
hiệu trong bảo quản, chế biến nguyên liệu tôm sau khi thu hoạch và tận dụng triệt
để nguồn phế phụ phẩm của tôm cho việc thu nhận protease chúng tôi tiến hành
thực hiện đề tài: “Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu
tôm sú”.
1.2. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
Mục đích chung của đề tài là tách chiết và tinh sạch protease từ nội tạng và
đầu của tôm sú cũng nhƣ tính chất của nó. Để đạt điều này, đề tài tập trung vào các
nội dung cụ thể sau:
 Xác định quy trình tách chiết protease từ nội tạng và đầu của tôm sú
Xác định tỷ lệ dung môi tách chiết protease thích hợp.
Xác định loại dung môi tách chiết protease thích hợp.
Xác định nồng độ tác nhân tủa thu hồi protein.
Xác định tác nhân tủa thu hồi protein.
 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động protease của chế
phẩm enzyme.
Khảo sát hoạt tính theo pH.
Khảo sát hoạt tính theo nhiệt độ.
Xác định độ bền của protease.
 Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.
 Xác định trọng lƣợng phân tử của protease bằng điện di protein.

Xem chi tiết: Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease nội tạng và đầu tôm sú