MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Những chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 3
1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4
1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn 5
1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn 6
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI 8
1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 8
1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 9
1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 10
1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy) 10
1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 11
1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 12
1.3.1. Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh 12
1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 15
1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 16
1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA
CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 18
1.4.1. Một số bệnh hại chè do nấm 18
1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật 21
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và hóa chất 24
2.1.1. Nguyên liệu 24
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 27
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè 27
2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 28
2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 28
2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh 28
2.2.2.3.Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 29
2.2.3. Bảo quản giống 29
2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 30
2.2.4.1. Đặc điểm hình thái 30
2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy 31
2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 31
2.2.5. Lên men tạo kháng sinh 32
2.2.5.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp 32
2.2.5.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon 33
2.2.5.3. Ảnh hƣởng của nguồn Nitơ 33
2.2.6. Các phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA 33
2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB 33
2.2.62. Khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR 34
2.2.6.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 35
2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu 36
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè 37
3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 38
3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn 38
3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao 41
3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2 42
3.3.1. Đặc điểm hình thái 42
3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy 43
3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 45
* Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon 45
* Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp 46
* Khả năng chịu muối 46
* Khả năng sinh enzym ngoại bào 47
3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 48
3.3.5. Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1 50
3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn 52
3.4.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp 52
3.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon 54
3.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ 56
3.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử 57
3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn 57
3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR 58
Chƣơng 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận 60
4. 2. Kiến nghị về những nghiên cứu tiếp theo 61
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO 63
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
XK : Xạ khuẩn
VSV : Vi sinh vật
CKS : Chất kháng sinh
HSCC : Hệ sợi cơ chất
HSKS : Hệ sợi khí sinh
KTKS : Khuẩn ty khí sinh
HTKS : Hoạt tính kháng sinh
HTKN : Hoạt tính kháng nấm
MT : Môi trƣờng
KHVQH : Kính hiển vi quang học
KHVĐT : Kính hiển vi điện tử
DNA : Deoxyribonucleic Acid
RNA : Ribonucleic Acid
ISP : International Streptomyces Project
TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid
SDS : Sodiumdodecyl sulfat
TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid
PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase)
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu chè làm nguồn phân lập các chủng nấm 37
Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu 39
Bảng 3. 3.Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè 40
Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn 41
Bảng 3.5. Đặc điểm nuôi cấy của chủng R2 và Đ1 44
Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2 45
Bảng 3.7. Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp của 2 chủng R2 và Đ1 46
Bảng 3.8. Khả năng chịu muối của 2 chủng R2 và Đ1 47
Bảng 3.9. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm
kiểm định 48
Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis 50
Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A. brunneofungu.52
Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng
lên men khác nhau 53
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CKS
của 2 chủng R2 và Đ1 55
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2
chủng R2 và Đ1 56
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh 38
Hình 3. 2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu 39
Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm 40
Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn 42
Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2 42
Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1 43
Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng 44
Hình 3.8. Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn 47
Hình 3.9. Hoạt tính kháng 3 chủng nấm kiểm định của 2 chủng Đ1 và R2 49
Hình 3.10: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng tổng hợp CKS 54
Hình 3.11: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp CKS 55
Hình 3.12 : Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS 57
Hình 3.13. Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn 58
Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu 59
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-1-
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm.
Mưa là điều kiện rất thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt là các VSV gây
bệnh thực vật. Vì vậy việc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật từ lâu đã phổ
biến ở Việt Nam. Song việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật thường là độc hại
và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức
khoẻ con người, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái.
Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái bình dương của FAO
năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM
(Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn
chế sự phát triển của các quần thể ký sinh. Một trong những hướng nghiên cứu
theo xu hướng này là sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế các quần thể
VSV gây bệnh. Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế
VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả
năng sinh CKS cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh.
Thái nguyên là tỉnh giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp. Trong đó cây
chè là cây loại cây chủ đạo và hàng năm các bệnh do nấm cũng đã gây ra
những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm. Vì vậy
việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống
nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo
vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững.
Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới
hiện nay cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong
phú của Thái Nguyên. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn
thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây
chè ở Thái Nguyên”.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-2-
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có
hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây chè.
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một
số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng
dụng.
3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài
* Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất
Thái Nguyên.
- Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên.
* Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV
kiểm định.
2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm
từ các mẫu đất khác nhau.
3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một
số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh đã được lựa chọn.
4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng
tạo thành CKS của các chủng đã lựa chọn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-3-
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN
1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân
bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng,
bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển
được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức
độ canh tác và thảm thực vật.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000
mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [43].
Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường,
chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5.
Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất
rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm.
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng
hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả
năng sinh chất kháng sinh.
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì
có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [6]. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc
từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes,
Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn
hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như
gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi.
Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá
nhiều hợp chất trong đất, nước. Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
-4-
amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể
gây bệnh cho người, động vật [7].
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
* Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh
mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ
sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng
0,2 1 m đến 2 3 m, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [10],[22].
Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc
vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một
trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm
mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 50 m, dễ
quan sát bằng mắt thường.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng
nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ,
da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.
Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ
vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm…
Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 2 mm nhưng cũng có khuẩn
lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn.
Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương
đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.
Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản
phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit
hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được
tiết ra trong môi trường.
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét